Multi-SIM助力钌配合物点亮活细胞 mtDNA 超分辨成像之路
背景知识
线粒体DNA(mtDNA)在细胞功能中起关键作用,其拷贝数和功能变化会引起许多疾病的发生,荧光显微镜是观察线粒体DNA的关键工具,清晰的采集到线粒体DNA的动态过程主要有两大限制:
第一:受光衍射极限限制,普通的荧光显微镜分辨率较低,成像速度慢,超分辨率显微镜(SRM, Super Resolution Microscopy)技术的发展打破了这一限制,其中SIM技术是SRM中可广泛应用于活细胞动态成像的方法。
第二:目前缺乏能够特异性靶向活细胞mtDNA的荧光探针。商业上可用的线粒体染料,如MitoTracker,并不是专门靶向mtDNA的。而传统的mtDNA染料多为有机染料,存在Stokes位移小、光漂白和发射寿命短等问题,无法满足SRM成像的需求。因此,迫切需要开发新型特异性用于mtDNA染色的超分辨荧光探针。
过渡金属配合物如钌、锇和铱多吡啶基成像剂具有长发射寿命、大Stokes位移和良好光稳定性等潜在优势,可作为荧光探针、光敏剂和发光治疗工具,但此前关于钌配合物在线粒体中的确切位置(mtDNA、膜间隙或蛋白质)仍不清楚。
助力研究新发现
2023年11月,中国科学院生态环境研究中心朱本占课题组在《Chemical Biology and Nucleic Acid Chemistry》期刊上发表重要研究成果—“Unprecedented enantio-selective live-cell mitochondrial DNA super-resolution imaging and photo-sensitizing by the chiral ruthenium polypyridyl DNA “light-switch” ”。朱本占科研团队发现[Ru(phen)2dppz]Cl2在适当的氯酚反阴离子存在下,能够通过形成脂溶性离子对复合物,特异性靶向细胞核和线粒体DNA,结合超分辨成像技术,实现对活细胞mtDNA的高分辨率成像。
Muti-SIM在该文章里的贡献
该工作利用Multi-SIM设备进行了超分辨成像及SIM Image Analyser做了相关数据处理,获得论文中高质量的线粒体及mtDNA的成像结果。
研究亮点
Multi-SIM 能清晰的分辨出MitoTracker(MTG)和[Ru(phen)2dppz]Cl2荧光探针在线粒体定位的差异。科研人员使用Single Slice SIM模态(纳析科技独家)进行成像,发现用Ru配合物染色可获高空间分辨率的线粒体图像,且3D-SIM显示MTG荧光发射集中在Ru周围,二者位于线粒体不同部位。
图注:在Multi-SIM系统上采集[Ru(phen)2dppz]Cl2染色的HeLa细胞线粒体的2D-SIM和3D-SIM 图像。A为[Ru(phen)2dppz]Cl2染色的细胞Wild field和SIM图像,沿白线的发光强度轮廓图显示SIM分辨率提高。B为[Ru(phen)2dppz]Cl2与MTG共染色细胞的3D-SIM 的最大投影图像,图像及分析结果显示两者无共定位。比例尺:5 μm。
朱本占科研团队通过Multi-SIM成像后获取两种染料对线粒体染色的3D图像,以更清晰确定Ru和MTG的定位,发现Ru的荧光发射类似MTG豌豆壳内的豌豆。进一步将Ru配合物与TOMM20-dronpa共染色,高分辨率3D渲染图像显示Ru的荧光发射在线粒体中呈点状斑点,证明Ru配合物与mtDNA结合。
图注:[Ru(phen)2dppz]Cl2与活细胞mtDNA结合的代表性图像。A代表Ru和TOMM20-dronpa在单个细胞中的成像结果,Ru标记mtDNA(红色),TOMM20-dronpa标记线粒体外膜(绿色),白色数字表示mtDNA数量,比例尺:5μm;B和C代表Ru和MTG的双通道3D-SIM及三维渲染图像,(B,比例尺:5 μm;C,比例尺:0.5 μm),红色斑点表示Ru染色的mtDNA,绿色条带表示MTG染色的线粒体膜。
借助共聚焦及超分辨成像设备Multi-SIM,研究人员发现Ru配合物的手性对细胞内DNA发光强度有影响,左旋对映异构体在细胞核和线粒体中的发光强度远高于右旋对映异构体,与共聚焦相比,Multi-SIM成像结果展示了Ru更精确的定位。
图注:手性Ru配合物的两个对映体的 confocal laser scanning microscopy (CLSM)与SIM成像结果,HeLa细胞分别用左旋和右旋对映异构体Ru配合物(100μM)染色30分钟(用于细胞核染色),然后用 PBS 洗涤后再孵育 3 小时的成像结果。
研究成果总结
总体而言,本研究针对[Ru(phen)2dppz]Cl2在超分辨成像中的应用展开探究,借助Multi-SIM的超分辨特点实现了新型荧光探针[Ru(phen)2dppz]Cl2对活细胞mtDNA标记后的成像结果,确定该配合物在线粒体中与mtDNA结合的确切位置,同时获得Ru配合物的左旋对映异构体与mtDNA的结合力更强等结论。
关于Multi-SIM
多模态结构光超分辨智能显微成像系统Multi-SIM系列产品是纳析科技研发团队历经十余年研发、设计、制造而成的结晶,作为一款具有自主知识产权的国产超分辨显微成像系统,突破了超分辨显微技术在光学分辨率上“卡脖已久”的技术限制,将超分辨系统分辨率提升至60 nm,Multi-SIM以其多模态、成像速度快、智能等特点可以开展二维、二维长时程、三维、三维长时程等相关数据采集,为基础生物医学、临床病理、药物精准筛选等研究提供出色的高速、长时程、超分辨活细胞成像全流程解决方案。