Multi-SIM超分辨显微镜在细胞自噬机制研究中的关键作用

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1. 清晰分辨各组中不同尺寸的LC3的环形结构

Multi-SIM成像结果直观呈现出CaMKIIβ对细胞自噬的影响。饥饿处理后，CaMKIIβ敲除的细胞中LC3标记的自噬小体的尺寸明显小于对照组细胞，表明 CaMKIIb 对自噬体形成起关键作用。

图注：在Multi-SIM系统上采集sfGFP-LC3转染的COS7细胞荧光图像，对LC3环直径进行定量分析（n=35）。比例尺：2 μm。

2. 精准捕捉FIP200复合物的动态变化

在对照组细胞中，FIP200和WIPI2从最初的聚集体逐渐形成环状结构，最终解离。而在CaMKIIβ KO细胞中，出现了如小点无法正常扩展、形成自噬体后无法闭合以及形成不规则环状结构等缺陷。这些细微且关键的差异在Multi-SIM超分辨长时程成像下清晰可见。

图注：用Multi-SIM对表达mGFP-FIP200和WIPI2-mCherry的COS7细胞进行长时程的动态成像结果（细胞饥饿3小时后，以15秒的间隔进行60分钟的超分辨成像）。在对照细胞（表达SNAP-CaMKIIβ的CaMKIIβKO细胞）中，FIP200/WIPI2小点会逐渐行程环状结构。随后FIP200/WIPI2会从环上解离并消失（P）。在CaMKIIβ KO细胞中观察到了三种（Class I、II、III）类型的自噬缺陷（Q-S）。对不同组的FIP200/WIPI2聚集体数量进行定量比较（T），CaMKIIβ KO细胞组的聚集体明显多于对照组。比例尺：1 μm，***p < 0.001。

3. 清晰分辨CaMKIIβ 聚集体和内质网的关系

张宏研究团队通过Multi-SIM超分辨成像发现，CaMKIIβ聚集体与内质网有多种位置关系，主要包括：小的CaMKIIβ聚集体附着在内质网上并随其移动（第I 类）；内质网通过锚定在静止的CaMKIIβ聚集体上进行重塑（第II 类）；内质网管朝着CaMKIIβ聚集体移动并与其接触（第III 类）。

图注：在COS7细胞中表达SNAP-CaMKIIb和GCaMP6f-CYB5，分别指示CaMKIIb聚集体（绿色）和内质网（红色）。白色箭头表示CaMKIIb聚集体与内质网的关系。比例尺：1 μm（B，C）；500 nm（D）

4.可视化CaMKIIβ、FIP200聚集体和内质网之间的相互作用关系

通过Multi-SIM中Time-Lapse成像助力分析揭示FIP200/CaMKIIβ/内质网的时空关联情况。

首先，多数FIP200聚集体在CaMKIIβ聚集体附近出现并出现信号增强，FIP200 聚集体向CaMKIIβ聚集体迁移并附着或者离开，在此过程中相邻的FIP200聚集体也会发生融合；

FIP200/CaMKIIβ与内质网也存在复杂的相互作用模式，从长时程的结果中可归纳为：FIP200聚集体在附着于内质网链的CaMKIIβ聚集体上生长（I类）或与其松散结合（II类）；附着FIP200聚集体的内质网链沿着CaMKIIβ聚集体滑动，将FIP200聚集体运输到远处与其他FIP200 聚集体融合（图III类）；最后FIP200/CaMKIIβ聚集体与内质网分离（IV 类）。

图注：，在COS7细胞中表达mGFP-FIP200、SNAP-CaMKIIβ和mCherry-scc61β，分别指示FIP200（绿色）、CaMKIIβ （F-G品红色，I-K红色）聚集体和内质网（灰色）。（F - H）CaMKIIβ聚集体和FIP200聚集体之间的关系代表性图像。白色箭头指示FIP200 聚集体向CaMKIIβ聚集体迁移并附着或者迁移离开，黄色箭头指示相邻FIP200聚集体的融合（G）。（I - L）CaMKIIβ聚集体/FIP200聚集体与内质网之间的关系代表性图像。品红色箭头指示FIP200聚集体，虚线圆圈指示CaMKIIβ聚集体，绿色箭头指示 CaMKIIβ聚集体，白色线条勾勒出内质网链。（H）与（L）代表不同类型关系的量化结果。比例尺：1μm（F，G，K）；200nm（I、J）。